kerafast 4014C1-2細胞系說明書
該鼠成纖維細胞系是4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1細胞系（目錄號ESA104）的衍生物，并將mtDNA保持在減少的拷貝數(shù)上。為了產(chǎn)生該細胞系，將維持mtDNA拷貝數(shù)在正常水平的親代細胞用質(zhì)粒pMA4014瞬時轉(zhuǎn)染，該質(zhì)粒編碼mCherry和FLPo，并針對轉(zhuǎn)染的細胞進行流分選。由于FLPo介導(dǎo)的在細菌LigA基因前面的MTS切除，導(dǎo)致4B6 / 3598/3442＃2/4011 / 4014C1-2細胞中線粒體LigA導(dǎo)入效率低下，并且mtDNA保持減少的拷貝數(shù)。該細胞系及其伴隨的同基因細胞系4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1（目錄號ESA104）可用于研究mtDNA拷貝數(shù)對細胞生理的影響。
來自南阿拉巴馬大學(xué)Mikhail F Alexeyev博士的實驗室。
技術(shù)指標提供者注釋參考文獻
技術(shù)指標
| 產(chǎn)品類別： | 細胞系 |
| 單元格類型： | 胚胎成纖維細胞 |
| 生物： | 老鼠 |
| 形態(tài)學(xué)： | 紡錘形合流 |
| 資源： | 鼠標E13.5胚胎 |
| 生物安全等級： | BSL 1 |
| 生長條件： | DMEM / 10％FBS。定期選擇10 µg / ml殺稻瘟素，2 µg / ml嘌呤霉素和1 mg / ml G418 |
| 傳代培養(yǎng)： | 每3天將1：4分割為1：8 |
| 冷凍保存： | DMEM / 10％FBS / 10％DMSO |
| 注釋： | 快速成長 |
| 存儲： | LN2 |
| 發(fā)貨： | 干冰 |
提供者
來自南阿拉巴馬大學(xué)Mikhail F Alexeyev博士的實驗室。
注釋
將Cre-TM小鼠（JAX 004682，B6.Cg-Tg（CAG-cre / Esr1）5Amc / J）與Lig3LoxP小鼠（Nature 471（2011）240-244）交叉雜交，以提供由肌動蛋白驅(qū)動的他莫昔芬誘導(dǎo)的Cre表達啟動子。從E13.5胚胎間充質(zhì)制備Lig3Cre-TM小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）。用編碼SV40大T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體3315使細胞永生（J.Biol.Chem.288（2013）26594-26605），并根據(jù)其形成菌落的能力進行選擇。選擇了一個克隆，以其優(yōu)異的生長特性命名為Cre4。用逆轉(zhuǎn)錄病毒2641（Mol.Biol.Rep.37（2010）1987-1991，其編碼Tet-On Advanced反式激活子，EGFP和殺稻瘟素抗性）轉(zhuǎn)導(dǎo)該克隆，從而產(chǎn)生命名為4B6的克隆。4B6是Cre4的Tet-On衍生物。用逆轉(zhuǎn)錄病毒rv3598（G418抗性）和rv3442（嘌呤霉素抗性）進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)Cre4，從而通過Cre介導(dǎo)的切除（rv3442）使細胞Lig 3基因失活，并重新表達沒有線粒體靶向信號的細菌LigA基因（ MTS，rv3598）。在不存在限制mtDNA復(fù)制的Lig 3的情況下，LigA的線粒體導(dǎo)入效率低下會使DNA連接酶活性升高，并導(dǎo)致mtDNA拷貝數(shù)降低。這些細胞用逆轉(zhuǎn)錄病毒rv4011轉(zhuǎn)導(dǎo)，該病毒編碼與來自人鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶的可激發(fā)的（FLPo）線粒體靶向序列融合的相同LigA。該融合蛋白被有效地導(dǎo)入線粒體，因此在轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞中恢復(fù)了正常的mtDNA拷貝數(shù)。后，用編碼mCherry和FLPo的質(zhì)粒4014瞬時轉(zhuǎn)染得到的細胞。由于FLPo介導(dǎo)的從LigA去除MTS，因此降低了所得克隆＃4B6 / 3598/3442＃2/4011 / 4014C1-2中的mtDNA拷貝數(shù)。該細胞系與同基因細胞系4B6 / 3598/3442＃2 / 4011C1結(jié)合使用，可用于研究mtDNA拷貝數(shù)對細胞生理的影響。
參考文獻
